11月22日，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所罗小舟研究员团队在学术期刊Metabolic Engineering上发表了题为One-pot selective biosynthesis of Tyrian purple in Escherichia coli的文章。这项研究针对Tyrian purple在生产上面临化学合成毒性大、海螺提取得率低及生物合成选择性低等问题，研究团队提出了一种简单的一锅法选择性生物合成Tyrian purple的方法，为Tyrian purple在天然染料及生物相容性半导体行业的规模化应用打下坚实的基础。 

　　Tyrian purple，中文名称为骨螺紫、泰尔紫，主要由6,6'-二溴靛蓝组成，是一种从海螺里提取的古老而珍贵的染料。它不仅被应用在纺织品染色领域，而且在陶器、建筑和壁画绘画等相关领域得到了广泛使用。在现代，Tyrian purple也很稀有，其售价高达4000美元/克（来源于Kremer）。根据市场调研公司Arizton的报告，2024年全球天然染料市场价值将达到50亿美元，消费者对天然染料染成的服装需求不断上升。同时，研究表明这种昂贵的染料除了传统用途之外还有其他用途，即其具有卓越的生物相容性半导体材料性能。它可被用于如染料敏化太阳能电池、功能聚合物薄膜材料和半导体材料等领域，具有广阔的应用前景（图1）。 

　　Tyrian purple的传统制备工艺极其复杂，涉及到从骨螺类动物的腺体中提取出一种分泌物，这种分泌物在氧化后会生成深紫色的染料。在18世纪，制取1.4 g Tyrian purple需要 12000只骨螺作为原料，这个过程需要大量的工作和时间。此外，海螺类动物利用色氨酸（Trp）合成Tyrian purple途径中，负责合成Tyrian purple中间体的基因和酶尚未被完全阐明，且通过海螺类动物的合成途径中的溴代中间体合成Tyrian purple仍然需要至少四步酶催化。目前化学合成Tyrian purple的规模一直停留在少量分析或小规模制备。主要原因是大多数方法需要使用溴气或氢溴酸进行溴化，而这些方法缺乏区域选择性，产率低且毒性大。而直接利用成本高昂的溴化前体开始合成也会限制Tyrian purple的大规模合成。因此，不论是利用传统的海螺提取、海螺生物合成途径还是化学合成的方法，目前均难以在工业上实现Tyrian purple的大规模生产。 

　　近年来，研究人员利用微生物（如细菌或酵母等）细胞工厂进行生物合成，以生产药物、生物燃料和其他有价值的化学品。这种合成生物学的方法已成为从可再生底物中可持续生产Tyrian purple的替代方案。Byung-Gee Kim等研究人员提出在大肠杆菌（E. coli）中利用色氨酸6-卤化酶，色氨酸酶和单加氧酶三步酶法从色氨酸合成Tyrian purple，这条Tyrian purple生物合成途径较为简单但面临两个很严重的问题，即色氨酸6-卤化酶体内催化色氨酸效率低和色氨酸酶对底物色氨酸和中间产物6-溴-色氨酸的催化缺乏选择性。色氨酸酶会与色氨酸6-卤化酶竞争底物，导致在单个细胞内合成只能获得大量的靛蓝副产物和极少的Tyrian purple。 

　　为了克服上述问题，罗小舟研究员团队提出了利用来自Streptomyces toxytricini的色氨酸6-卤化酶SttH、来自E. coli的色氨酸酶TnaA和来自Providencia Rettgeri GS-2菌中的吲哚氧化酶/还原酶GS-C和GS-D（GS-CD）从色氨酸合成Tyrian purple的方法。该团队首先对色氨酸6-卤化酶进行优化。为了增强色氨酸6-卤化酶（SttH）和来自E. coli的黄素还原酶（Fre）融合酶Fre-L3-SttH的可溶性表达及催化效率，该研究引入了GroEL/GroES分子伴侣系统，同时优化了表达载体，使Fre-L3-SttH融合酶的可溶性表达明显增强。（图2） 为了增强Fre-L3-SttH融合酶的体内催化效率，该研究进一步对培养基、卤化物盐和诱导剂的浓度进行了优化，使Fre-L3-SttH融合酶的体内催化转化率提升到了75%（图3）。上述策略不仅为黄素依赖型色氨酸卤化酶的体内活性的增强提供了一种方法，也为Tyrian purple的生物合成奠定了基础。 

　　研究团队前期在Providencia Rettgeri GS-2菌中发现了一个新的双组分吲哚氧化酶GS-CD，其合成Tyrian purple的效果比之前报道的单加氧酶MaFMO和细胞色素P450酶CYP102G4更好。该研究还使用了一条刚性的短肽L3将色氨酸酶（TnaA）与GS-C的N端融合，获得双功能融合酶TnaA-L3-GS-C。基因GS-D被放置在GS-C的下游，由一个独立的RBS控制其翻译。TnaA-L3-GS-C+GS-D（TnaA-L3-GS-CD）体内催化6-溴-色氨酸合成Tyrian purple的转化率高达67.5%，可用于Tyrian purple的生物合成（图4）。 

　　为了实现在大肠杆菌体内通过一锅法实现从Trp到Tyrian Purple的合成。研究人员将Fre-L3-SttH 和TnaA-L3-GS-CD与分子伴侣pGro7在大肠杆菌BL21（DE3） TnaA中进行共表达（图5a、b）。结果表明，在该体系中添加1000 M Trp 底物反应 48 h 后，能产生 17.6 M（7.4 mg L-1）的Tyrian Purple（图5d）。然而，靛蓝仍然作为主要副产物存在，产量为 242.0 M（图5d）。由于TnaA会与SttH竞争Trp底物，导致Tyrian Purple的产量较低。这成为在大肠杆菌中通过一锅法从Trp生产Tyrian Purple的主要障碍。为了获得更高的Tyrian Purple转化率及产生最少的靛蓝副产物，有必要在时间上对TnaA与SttH这两个酶催化反应进行分离。 

　　为了克服选择性问题，产生最少的靛蓝副产物，该研究采用了 pL/pR-cI857热诱导系统来精确调控TnaA-L3-GS-CD的表达。研究人员设计了一个三阶段的培养及诱导过程，如图6a所示：在30 C下的细胞生长阶段，同时启动Fre-L3-SttH和分子伴侣groEL/groES的表达。此阶段pL/pR启动子处于抑制状态，因此不能启动TnaA和GS-CD的表达。在42 C的热诱导阶段，当温度升至42 C，热不稳定的阻遏蛋白cI857被释放并允许转录TnaA和GS-CD。随后是温度调回30 C的重组蛋白持续表达阶段，此阶段持续表达Fre-L3-SttH、TnaA和GS-CD。该研究通过优化细胞生长时间及在42 C下的热诱导时间，最终实现了从色氨酸选择性生产Tyrian purple，产量为31.1 M（13.1 mg L^-l）（图6b和 6c）。然而，研究发现在最佳条件下，即使投喂充足的中间产物6-Br-Trp，热诱导表达系统调控TnaA和GS-CD表达合成Tyrian purple的产量也只能达到20.4 M（图6d），这表明热诱导表达系统中的pL/pR启动子应该早于14小时开始启动。 

　　为确保Fre-L3-SttH足够高效从而允许pL/pR热启动子提早启动，该研究再次优化了NaBr的添加浓度及补充酵母提取物来增强培养基营养。在最终添加150 mM NaBr的M9-Br-CAA培养基中添加0.1% 的酵母提取物，在30 C下反应8小时后，该研究能够从500 M色氨酸中选择性地合成44.5 mg L^-1的Tyrian Purple（图7）。该研究为首次报道的通过一锅法在E. coli中选择性地合成Tyrian Purple，有助于降低Tyrian Purple的生物合成成本，为Tyrian Purple的大规模生产奠定一定的基础。这种选择性地一锅法生物合成Tyrian purple的方法也为其它卤代靛蓝染料的生物合成提供了一种方法，这对于靛蓝类染料用作细菌染料、生物相容性半导体材料以及抗菌涂层或材料具有重要意义。

　　中国科学院深圳先进院合成生物学研究所研究员及内蒙古大学客座博导罗小舟为本文的通讯作者，内蒙古大学与中国科学院深圳先进院联培博士研究生李菲菲为本文的第一作者。该研究获得国家重点研发计划、国家自然科学基金委、广东省基础与应用基础研究基金委、深圳市科技计划等多个项目的支持，以及深圳市微生物药物智能制造重点实验室、深圳合成生物学创新研究院和定量合成生物学重点实验室等平台的支持。 

 

　　  

　　图1 Tyrian purple的应用 

　　  

　　 

　　图2 优化表达载体、分子伴侣和培养基以增强Fre-L3-SttH融合酶的可溶性表达及催化活性 

　　a. Fre-L3-SttH融合酶在T7或BAD启动子控制下的表达载体优化。b.不同构建的Fre-L3-SttH的可溶性表达水平。箭头分别指示Fre-L3-SttH（红箭头）和GroEL（橙箭头）的表达。通M表示蛋白分子量标记；T表示全菌；S表示上清。c. BAD-p15A和BAD-BBR1表达载体中Fre-L3-SttH融合酶与不同分子伴侣共表达的优化。d.培养基的优化 

　　 

　　图3 Fre-L3-SttH融合酶的体内优化 

　　a. M9培养基组分的优化。b. NaBr浓度的优化。c. 诱导剂浓度的优化。 

　　  

　　 

　　图4 在大肠杆菌中从6-Br-Trp底物到Tyrian purple的转化 

　　a. 共表达TnaA和GS-CD或利用双功能酶TnaA-L3-GS-CD时，Tyrian purple的转化率。 b. 体内反应中利用TnaA-L3-GS-CD 以6-Br-Trp为底物时，Tyrian purple的转化率 

　　  

　　 

　　图5 在大肠杆菌体内通过一锅法生物合成Tyrian Purple 

　　a. 利用Fre-L3-SttH和TnaA-L3-GS-CD生物合成Tyrian Purple的示意图。b. Fre-L3-SttH和TnaA-L3-GS-CD与分子伴侣groES/groEL在大肠杆菌中进行共表达的体系构建示意图。c. 6R-TnaA-L3-GS-CD 与分子伴侣groEL/groES共表达的体系构建示意图。d. 利用Fre-L3-SttH和TnaA-L3-GS-CD与分子伴侣groES/groEL共表达反应系统进行Tyrian Purple发酵48小时的结果。e. 利用Fre-L3-SttH和6R-TnaA-L3-GS-CD 与分子伴侣groEL/groES共表达反应系统进行Tyrian Purple发酵48小时的结果 

　　  

　　 

　　图6 利用热调控体系选择性地生物合成Tyrian purple 

　　a. 利用热调控体系调控TnaA-L3-GS-CD表达的过程。b. 细胞生长时间的优化。c. 在42 C诱导时间的优化。d. 在温控诱导系统中通过投喂100-1000 M 6-Br-Trp底物反应24小时后Tyrian purple的产量 

　　 

　　图7 获得高纯度的Tyrian purple 

　　a. 不同浓度NaBr盐浓度的优化。 b.不同浓度的酵母提取物的优化。c. Tyrian purple的产量：M9-Br-CAA培养基中添加150 mM NaBr和0.1%的酵母提取物，细胞生长时间为8小时。 d. 在100 mL带挡板的玻璃锥形瓶中，使用25mL的反应体系进行Tyrian Purple发酵的结果  

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