科研进展

Metab. Eng. | 组合优化和空间布局改造细胞色素P450酶以控制氧化产物的产物比例

时间:2023-10-10  来源:合成所 文本大小:【 |  | 】  【打印

  9月26日,中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所Howard Chou团队在Metabolic Engineering上发表了题为Combinatorial optimization and spatial remodeling of CYPs to control product profile的研究成果。在该研究中,研究人员通过组合优化策略,在酿酒酵母中成功构建了细胞色素P450氧化酶(CYP)和细胞色素P450氧化酶还原酶(CPR)的氧化网络,实现特定三萜皂苷quillaic acid(QA)的高效生物合成。

  QA是多种皂树皂苷的苷元,而皂树皂苷已经被开发成多种疫苗的佐剂。本研究通过迭代筛选氧化还原库中的CYP-CPR组合,解决了从 -amyrin(BA)到QA生物合成过程中三个不同位点上六步氧化反应的平衡问题;并通过工程化改造酿酒酵母的内质网和减小不同CYP间的空间距离,进一步提高了CYP网络的氧化效率。在多达47个潜在氧化产物的产物谱中,QA的比例达到86%,产量达到2.23 g/L。该研究所提出的CYP氧化网络概念为调控多种CYP参与的复杂氧化通路生物合成提供了新的思路,并为控制产物的专一性提供了新的方法。 

  以QS-21、QS-7、QS-17为代表的皂树皂苷已经作为天然免疫佐剂被广泛应用于带状孢疹、疟疾、和Covid-19等疫苗中。而在皂树中发现的58种三萜皂苷中,有49种皂苷的苷元为QA。构建高产QA的酵母细胞工厂可以为高效生物合成QS-21等天然免疫佐剂奠定基础。在QA的生物合成中,需要将BA的C-16、C-23、和C-28分别氧化为羟基、醛基、和羧基。高效生物合成QA需要实现这三个位点的氧化平衡,否则会出现46种过氧化或不完全氧化的副产物(图一),而过多的副产物不仅降低目标化合物产量,也增加纯化成本。 

  在本研究中,研究人员首先构建了可以生产BA的底盘菌株,并利用该底盘筛选了12个不同的CYP以确定最优的候选基因用于QA的生物合成。实验发现CYP716A12在氧化BA的C-28生成Oleanolic acid (OA)时效率最高,CYP716A262氧化OA生成EA时的效率最高,CYP714E19主要氧化OA生成C-23羟基产物hederagenin(HE),而CYP72A567主要氧化OA生成C-23醛基产物gypsogenin (GY)和C-23羧基产物gypsogenic acid(GA)。前期文献报道CYP716A262可以直接将BA的C-16和C-28分别氧化成羟基和羧基得到echinocystic acid(EA)。有别于传统代谢工程思路去增强CYP716A262基因的表达,本研究通过迭代筛选CYP发现了CYP氧化的网络效应。相较于同时表达CYP716A262和CYP716A12,表达两个拷贝的CYP716A262的EA产量要低32.9%(图三)。 

  研究人员随后考察了CPR对CYP网络的影响。在考察了不同的CYP-CPR组合后,发现CPR不仅对氧化产物的产量产生影响,并会改变产物谱中不同产物的比例(图二)。研究人员同时发现在表达植物的CYP时,来源自动物或者真菌的CPR有时比植物的CPR能够更好的提高目标化合物的产量和比例。CPR筛选实验发现CrCPR与CYP716A12组合时效果最好。通过在BA高产底盘中表达CrCPR、CYP716A12、CYP716A262、和CYP72A567到了菌株yQA11。摇瓶发酵其QA的产量仅为21.3 mg/L,并且有大量的前体OA和EA积累。此外通过迭代筛选也发现,SaCPR与CYP716A262和CYP72A567的组合较佳。 

  虽然强化代谢流通量是提高产量的有效手段,但是研究人员发现过表达酿酒酵母内源的erg1只能增加双位点的氧化产物如EA和HE的产量积累,并不能增加QA的产量,从而证明单纯增加前体供应对于三位点氧化产物的积累影响较小(图三)。 

  研究人员随后通过再次迭代筛选候选CYP和CPR,发现表达两个拷贝的CYP72A567和一个拷贝的CYP714E19时QA的产量要高于表达三个拷贝的CYP72A567(图四),再一次证明了CYP氧化的网络效应存在。而在CYP网络中引入能与CYP72A567和CYP716A262更好组合的SaCPR,也可以进一步提高QA的产量。通过在菌株yQA11中再增加一个拷贝的CYP72A567,并引入CYP714E19和SaCPR得到菌株yQA12P,QA的产量增加了350%,达到95.9 mg/L。 

  研究人员随后发现在CYP网络中引入来自拟南芥的MSBP1能够降低不同CYP在内质网上的空间距离,并减少因底物扩散导致的中间体积累,从而将QA的产量从95.9 mg/L提高到172 mg/L(图五)。最后通过增加辅因子NADPH的供给和过表达酵母内源基因ice2以增加内质网的空间面积,QA的产量达到258 mg/L。通过在1 L的发酵罐中进行分批补料发酵,QA的产量达到2.23 g/L(图六),比前期报道的产量高7倍。 

  该论文的第一作者是杨加增助理研究员,Howard Chou正高级工程师为本文的通讯作者。罗小舟研究员和Jay Keasling教授也为本研究提供了资源支持,并在实验设计和论文写作上提供了指导。 这项工作得到了国家重点研发计划(2020YFA0907700),国家自然科学基金(22050410274和32101183)、比尔及梅琳达 盖茨基金会(INV-025841)、广东省基础与应用基础研究基金(2021B1515020049和2023A1515011338)、中国博士后基金(2020M682988)和深圳合成生物学创新研究院的支持。 

 

  

 

图一:从BA到QA的生物合成涉及47个氧化产物

图二:组合优化策略发现CYP-CYP和CYP-CPR组合提高特定位点氧化活性

图三:CYP的活性和产物谱具有情景依赖性

图四:通过完善CYP的网络效应进一步提高QA的产量

图五:减小CYP在内质网上的空间距离提高QA产量

 

图六:优化后的CYP网络产物谱倾向于积累QA