许多生物过程是通过蛋白质和核酸的分子相互作用来执行和调节的，包括蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-RNA相互作用和蛋白质-DNA相互作用。这些相互作用关系的失衡会导致人类各种疾病的发生，如癌症、免疫失调和神经退行性疾病等。因此，研究细胞中这些分子间的相互作用的方法对了解人类疾病的生物学过程及其治疗提供有利的工具。 

　　传统的亲和纯化和酵母双杂交方法已被广泛应用于发现潜在的分子相互作用。基于抗体的亲和纯化与基于质谱的蛋白质组学结合，可以富集和鉴定与特定蛋白质分子发生稳定相互作用的其他蛋白分子。这些技术的发展扩大了我们对各种系统中蛋白质相互作用网络的理解。亲和纯化也可以结合交联和核酸测序来鉴定蛋白与核酸间的相互作用，如染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)和RNA免疫沉淀测序(RIP-seq)。然而，亲和纯化的主要局限性是，在细胞裂解和随后的洗涤步骤中，往往会失去微弱或短暂的相互作用。为了克服这一点，亲和纯化可以与交联相结合，但交联后假阳性较高。此外，亲和纯化在应用于不溶性靶点或缺乏高亲和抗体的蛋白诱饵方面具有挑战性。酵母双杂交和其他蛋白质互补实验代表了另一种绘制活细胞中蛋白质间、蛋白质与RNA、蛋白质与DNA相互作用的方法。这些方法通常是高通量的，能够筛选成千上万个潜在的分子间相互作用。然而，许多蛋白质互补分析具有局限性，比如酵母双杂交不能研究膜蛋白。 

　　临近标记技术(Proximity labeling，PL)的发展为传统的在活细胞中研究分子间相互作用的方法提供了补充，该技术一般利用CRISPR基因编辑技术或基于质粒的表达将临近生物素化酶与诱饵蛋白在细胞内融合表达。在添加外源生物素后，诱饵蛋白临近的蛋白质会被生物素化，这些生物素化的蛋白质可以被链霉亲和素偶联的磁珠富集，之后可以通过质谱进行分析鉴定。目前最常用的临近生物素化酶包括抗坏血酸过氧化物酶APEX/APEX2、辣根过氧化物酶HRP和生物素连接酶BioID、 BASU、TurboID、miniTurbo等。 

　　工程化抗坏血酸过氧化物酶(APEX2)是由源自植物的抗坏血酸过氧化物酶经工程化改造而来。APEX2是一种非常快速的临近标记过氧化物酶，它可以与生物素苯酚在H2O2的催化下生成生物素-苯氧自由基，这些自由基与富含电子的特定氨基酸(如Tyr、Trp、Cys和His)反应，使生物素被共价连接到蛋白质上。由于苯氧基的半衰期很短(<1 ms)，又不能透过生物膜，使其活性范围限制在20 nm以内，因此只有距离目标蛋白20 nm以内的蛋白质会被标记。另外，APEX2标记的另一大优势便是反应速度很快，1 min内即可完成所需的标记。 

　　如上所述，尽管APEX2作为临近标记酶有很大优势，但是目前现有的研究方法依赖于基因编辑技术，需要将工程化酶在细胞内表达外源融合蛋白，这限制了其在难以转染的细胞系、原代细胞、组织和病理样品中的应用，且不能应用于翻译后修饰的蛋白(例如组蛋白修饰)。为了解决这些限制条件，甘海云课题组研究开发了一种由抗体介导的pA-APEX2临近标记新技术 (AMAPEX)。该技术将Protein A与经过改造的抗坏血酸过氧化物酶APEX2结合形成pA-APEX2，通过特异性的抗体，将pA-APEX2靶向到被修饰的目标组蛋白。当细胞中存在底物生物素酚和过氧化氢时，APEX2可以把生物素标记到距目标蛋白半径约20nm范围内的所有临近蛋白上。之后由于生物素与抗生物素蛋白链霉亲和素(Streptavidin)之间的极强的亲和力，可以利用链霉亲和素磁珠将生物素标记的蛋白质纯化出来，最后通过LC-MS/MS分析便可鉴定出目标蛋白周围的蛋白质，进而研究哺乳动物细胞中蛋白质-蛋白质的相互作用关系。如图1所示。 

图1 抗体介导的pA-APEX2临近标记方法构建流程 

　　通过质谱分析，该方法可精准鉴定出了小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中组蛋白H3K27me3相关PRC1和PRC2亚基复合物，并与已有两种方法的比较(BAC-GFP[1] 和 ChromID[2])，其鉴定范围和准确度有较大提升。此外通过CO-IP验证了NSD2与H3K27me3存在相互作用，证明了该方法的实用性(图2)。 

　　总体而言，AMAPEX 是一种非常有效的工具，我们可以通过它识别与修饰组蛋白相邻的蛋白质，研究蛋白质间的相互作用，拓展对蛋白间互作网络的认识，进而有助于我们探明由调控网络紊乱造成的各种疾病的发生机理，从而为疾病治疗奠定基础。 

图2 利用AMAPEX方法鉴定组蛋白H3K27me3临近蛋白质组 

　　该工作中由甘海云研究员团队完成的研究得到了基金委国家重点研发计划、国家自然科学基金重大专项、国家自然科学基金面上项目、广东省合成基因组学重点实验室、以及深圳合成生物学创新研究院的资助。 

　　参考文献[1] Vermeulen M, Eberl HC, Matarese F, Marks H, Denissov S, Butter F, Lee KK, Olsen JV, Hyman AA, Stunnenberg HG et al (2010) Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell 142: 967-980 

　　[2] Villasenor R, Pfaendler R, Ambrosi C, Butz S, Giuliani S, Bryan E, Sheahan TW, Gable AL, Schmolka N, Manzo M et al (2020) ChromID identifies the protein interactome at chromatin marks. Nat Biotechnol 38: 728-736 

　　PI简介： 

　　甘海云博士，中科院深圳先进技术研究院合成生物学研究所研究员，博士生导师。近五年来研究成果发表在Science、Nature medicine、 Molecular Cell、Nature Communications、Genes & development、eLife、PNAS、The EMBO journal、Nucleic acids research、Mol Cell Proteomics等知名期刊，累计引用超过2300次。 

　　课题组简介： 

　　甘海云课题组主要研究方向为利用系统生物学、合成生物学研究表观基因组信息的传递机制以及肿瘤发生和耐药性产生的表观遗传调控机制。 

　　现招聘有表观基因组学、系统生物学、肿瘤生物学、细胞生物学、生物化学与分子生物学等相关研究背景博士后3-4名，研究助理1-2名，欢迎感兴趣的朋友联系hy.gan@siat.ac.cn。 

　　实验室主页: 

　　http://isynbio.siat.ac.cn/ganlab/