近日，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所马英新研究员在学术期刊《Viruses》上在线发表了题为“Design and Application of Biosafety Coronavirus Engineering Systems without Virulence”的综述。

文章以冠状病毒研究为主线，全面总结了现有的生物安全冠状病毒工程系统，详细介绍了其构建方式和应用，这些系统将病毒学基础与合成基因组学技术相结合，用于开发减毒或无毒疫苗的有效工具、筛选抗病毒药物以及研究新型微生物的致病机制。在探讨了这些系统为冠状病毒的研究和治疗带来极大便利的同时，也对其未来发展趋势做了展望。

深圳先进院与澳门科技大学联合培养博士生吴国强和深圳先进院与天津科技大学联合培养硕士生李巧玉为文章的共同第一作者，深圳先进院马英新研究员和毛国斌副研究员为文章的共同通讯作者。

文章上线截图

文章链接：https://www.mdpi.com/1999-4915/16/5/659

在近二十年的时间内，共出现了三种致命的人畜共患型冠状病毒（CoV），分别是严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和SARS-CoV-2。其中由SARS-CoV-2引起的2019年冠状病毒（COVID-19）大流行，在全世界范围内造成了严重的经济和生命损失。此外，还有四种常见的低致病性冠状病毒，在传播过程中通常引起不同程度的呼吸道和肺炎症状，分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1（如图1）。

图1 冠状病毒爆发的时间线

冠状病毒造成的损害是不可逆转的，迫切需要对其进行充分研究。当前，冠状病毒的相关研究都是在BSL-3或BSL-4实验室中进行的，其局限性严重阻碍了基础病毒学研究，具有生物安全性的工程化病毒系统，能够使实验人员在传统实验室中对高传染性病毒进行研究。文章重点介绍了以合成基因组学构建病毒基因组的方法及多种工程化冠状病毒系统的构建和应用。

合成DNA已被广泛应用于研究、诊断和治疗等领域，其重要应用之一则是构建合成型基因组。在没有天然模板的情况下从头合成病毒基因组对病毒学研究至关重要，它为全面了解病毒基因的功能和表达及其致病机制提供了新的技术手段。此外，利用该技术，还可以对病毒基因组进行大规模的遗传修饰和功能表征，这是传统分子生物学方法无法实现的。反向遗传学是另一种基于生物遗传信息，通过修改特定基因或非编码核酸，如通过靶向基因突变或基因插入/删除/替换，来研究基因组结构和功能的方法。此外，它不仅可以用于全面分析分子特征、发病机制和病毒-宿主相互作用，还可以通过直接操纵RNA病毒基因组开发新型疫苗。反向遗传学的基本构建策略是：（1）通过RT-PCR或化学合成获得病毒基因组的所有DNA片段；（2）通过靶向RNA重组、体外连接、转化相关重组或环状聚合酶延伸反应（CPER）将这些片段组装成全长互补DNA（cDNA），然后（3）将获得的cDNA转染到易感细胞内，完成病毒拯救（如图2）。合成基因组学和反向遗传学被广泛用于病毒的全基因组合成，包括SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2等，成为病毒学研究中不可或缺的工具。

图2 反向遗传学的常用构建策略

另外，开发具有生物安全性的工程化病毒系统也是至关重要的（如图3）。病毒样颗粒（VLPs）是由一个或多个病毒结构蛋白自组装形成的中空颗粒，形态与野生型病毒相似且可以特异性侵染宿主细胞。VLPs以高密度展示外源抗原表位，能够促进抗原呈递细胞的摄取，从而有效诱导细胞免疫和中和抗体反应。假病毒（Pseudovirus）是通过重组来自不同病毒的骨架蛋白和包膜蛋白构建而成的。常用的骨架病毒包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、水疱性口炎病毒（VSV）和小鼠白血病病毒（MLV）。另一种提高生物安全性的常用策略是构建病毒复制子（Replicon），这是一类可自我复制的亚基因组系统，通常会通过报告基因取代编码病毒结构蛋白的基因。另两种工程化病毒系统分别是反式互补系统（Trans-Complementation System）和基因组拆分系统（Split-Virus-Genome System,SVG），构建得到包含所有病毒成分的基因组缺陷病毒，能够模拟真实的病毒生命周期，且不产生子代病毒，用以研究蛋白质功能和病毒粒子组装。

 
图3 具有生物安全性的工程化病毒系统的构建

具有生物安全性的工程化病毒系统已成功应用于SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2等病毒的研究中。这些工具在病毒突变株、中和抗体制备、疫苗和抗病毒药物开发以及病毒生命周期的研究等方面发挥了巨大作用，实现了在BSL-2实验室内对高传染性病毒的研究，满足了病毒学研究的迫切需求。然而，由于冠状病毒庞大的基因组及易突变性，工程化病毒系统仍然存在许多局限性。随着基因编辑技术、生物信息学、人工智能的快速发展，使得基因的精准修饰、病毒结构分析、传播模式研究变得更加容易和高效。研究人员有望通过更精准、更快速的干预方法降低烈性病毒的传染性和致病性，推动冠状病毒的安全性研究，更好地应对未知的新型传染病。

该工作得到了国家自然科学基金、科技部、中国科学院、广东省、深圳市及深圳合成生物学创新研究院等多个项目的支持。