近日，中国科学院深圳先进技术研究院周佳海课题组和浙江大学杜艺岭课题组和合作在JACS上发表了题为Conserved Enzymatic Cascade for Bacterial Azoxy Biosynthesis的研究论文。该研究揭示了微生物中氧化偶氮类天然产物关键结构基团生物合成的酶学基础，发现了一个新颖的铁离子依赖型膜结合氮-氮键合酶和一个双铁家族的氧化偶氮合酶。研究结果显示由这两个新家族金属酶共同催化的酶促反应序列可能是细菌中不对称氧化偶氮类天然产物生成的保守策略（图1）。 

　　氮-氮（N-N）键结构基团是众多化学合成类药物和活性天然产物的重要药效团，其生物合成的酶促机理近年来获得了极大关注（图2a）。挖掘和研究含氮氮键天然产物生物合成途径中负责氮-氮键合成的酶家族，可以为通过合成生物学技术实现众多药物的绿色制造提供理论指导和生物催化元件。氧化偶氮类（Azoxy）天然产物含有共同的官能团（RN = N⁺(O^-)R），该家族化合物具有多样化的结构和生活学活性，其中包括苏铁毒素cycasin、真菌抗生素calvatic acid、抗肿瘤和抗菌分子valanimycin、抗结核分子elaiomycin和杀线虫分子jietacin等等（图2b）。同时，氧化偶氮分子也已被鉴定为外源的肼或偶氮类异生物（如许多临床药物、食品或染料）在人体内生物转化过程中产生的重要代谢中间产物，其在某些条件下可进一步转化为具有致癌作用的重氮离子。尽管对于不对称氧化偶氮类天然产物生物合成机理的研究已经经历了数十年，但其关键氧化偶氮键基团形成的酶学基础仍然是一个谜。 

　　研究首先通过在大肠杆菌体系中部分重构valanimycin的生物合成途径，揭示了膜蛋白VlmO能够将一个不稳定的酯中间体2转化为含氮氮键的肼基产物4（图3）。随后，研究人员通过将化学合成的valanimycin生物合成基因簇导入底盘宿主Streptomyces albus J1074中，成功获得了valanimycin的生产菌株。进一步通过体内基因敲除实验验证了vlmO基因对于valanimycin的生成是必不可少的。基于膜组分进行的体外生化实验显示VlmO催化氮氮键合成的反应活性依赖于金属铁离子，因此VlmO是一个新颖的铁离子依赖型膜结合氮-氮键合酶。 

　　接下来，研究人员进一步探索了valanimycin生物合成途径中氮氮键形成之后的反应。研究发现基因簇上编码的双铁金属蛋白VlmB可以将肼基中间体4转化为含氧化偶氮基的产物3（图3）。厌氧条件下的反应和¹⁸O标记实验揭示了氧化偶氮的氧原子来源于分子氧。有意思的是，VlmO催化的四电子氧化反应不需要提供外源的还原剂。UV-vis光谱学研究和厌氧条件下的中间体鉴定实验显示了肼基底物4可以提供电子还原VlmB的双铁中心来激活氧气分子，肼基底物4自身则被氧化成偶氮中间体12，后者再经历N-氧化反应生成valanimycin特征性的氧化偶氮基团。VlmB与底物的共晶结构显示双铁中心由四个谷氨酸残基 (Glu84, Glu114, Glu180, and Glu212)和两个组氨酸 (His117 and His215)组成。此外，精氨酸残基Arg80通过氢键与底物的羧基相互作用，是VlmB催化活性必不可少的关键氨基酸。随后，研究人员还进一步对其他氧化偶氮类分子（Elaiomycin和KA57-A）中VlmO/VlmB的同源蛋白的功能进行了探究，结果显示由VlmO/VlmB催化的酶促反应序列可能是微生物中不对称氧化偶氮类分子生物合成的保守策略（图4）。 

　　综上，本研究发现了一种由两个新型铁离子依赖型酶家族共同催化的“hydrazine-azo-azoxy”的酶促反应序列是微生物氧化偶氮类天然产物生物合成的保守策略。该研究成果不仅揭示了长期以来氧化偶氮基团生成的酶学基础，而且也为通过基因组挖掘方法精准发现该家族新活性化合物提供了基因标记。 

　　本文的共同第一作者为中国科学院深圳先进技术研究院周佳海课题组的臧鑫和浙江大学杜艺岭课题组的史晶坤，通讯作者为周佳海和杜艺岭研究员。该工作受到国家自然科学基金委项目（32122005）、国家重点研发计划项目（2019YFA09005000）和 深圳市科技项目（ZDSYS20210623091810032）的支持。VlmB与底物的复合物晶体衍射数据收集得到了上海光源和国家蛋白质科学研究（上海）设施生物大分子晶体学线站BL19U1工作人员的帮助。 

图1. 微生物中一种保守的氧化偶氮基团的酶促合成策略 　　  

图2. 部分含氮-氮（N-N）键类活性天然产物（a）及氧化偶氮家族化合物（b） 　　  

图3. Valanimycin生物合成途径中VlmO/VlmB参与的氧化偶氮基生成反应 

图4. Elaiomycin和KA57-A生物合成途径中的氧化偶氮基生成反应 

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