与外周血管相比，中枢神经系统的血管具有高度特化的解剖和功能特征，统称为血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）。血脑屏障对维持中枢神经系统微环境稳态、促使其行使正常神经活动具有重要作用。近年来，血脑屏障功能紊乱被证明与多种神经系统疾病的发生发展密切相关，包括阿尔兹海默症、脑卒中及脑胶质瘤等。血脑屏障结构上由血管内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞、胞外基底膜以及神经细胞等构成。其中，作为外周组织和血液成分进入脑组织的第一道屏障，脑血管内皮细胞的各项生理特性对血脑屏障功能起主要的决定作用，然而决定这些生理特性的分子基础尚不完全清楚。

　　近日，中国科学院深圳先进技术研究院畅君雷研究员、中山大学生命科学学院徐锦教授和美国斯坦福大学Calvin J. Kuo教授合作，在Cell Reports期刊在线发表了题为Integrative multi-omic profiling of adult mouse brain endothelial cells and potential implications in Alzheimer’s disease的研究论文。研究人员利用多组学测序技术在转录组、蛋白质组及染色质可及性等多个层面进行整合分析，构建了成年小鼠脑血管内皮细胞全面的分子图谱，并进而鉴定了在脑血管内皮细胞中选择性富集的转录本、蛋白质、顺式调控元件(CREs)和转录因子(TFs)，并分析了它们之间的相关性。该研究还进一步鉴定了小鼠脑血管内皮细胞富集蛋白和转录因子在正常人类脑血管内皮细胞中的保守性，以及其表达水平在阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）小鼠模型中发生的变化。 

　　首先，研究人员基于流式分选技术分离得到高纯度的成年小鼠脑组织及外周组织（肝脏、肺脏）的血管内皮细胞。利用转录组测序和定量蛋白质组学技术（DIA-MS），研究人员鉴定了相较于外周组织血管内皮细胞，在脑血管内皮细胞中选择性富集的转录本和蛋白质，并分析了它们的相关性。结果表明，在脑血管内皮细胞中选择性富集的转录本和蛋白质之间存在部分但显著的非相关性，最富集的脑血管内皮细胞转录本中仅有约10%在蛋白质水平上也显著富集，而许多脑血管内皮细胞富集的转录本编码的蛋白质未被检测到。另一方面，在脑血管内皮细胞中选择性富集的蛋白质中约有50%的转录本水平与外周血管内皮细胞中该蛋白质的转录本水平没有显著差异。这些结果表明，获得基因的蛋白质表达水平的信息而不仅仅依赖其转录本表达水平，对于研究基因在血脑屏障中的功能以及充分了解血脑屏障如何形成、维持和调节十分重要。 

　　其次，研究人员还利用ATAC-seq分析鉴定了在脑血管内皮细胞中特异性开放的染色质区域，并利用转录因子的结合motifs进行富集分析发现，来自TCF/LEF、SOX和ETS转录因子家族的motifs在小鼠脑血管内皮细胞染色质特异性开放区域中显著富集。结合上述的转录组学和蛋白质组学数据，研究人员进一步确定了转录因子LEF1、SOX17和ERG可能独立或合作调节血脑屏障功能基因的表达，对血脑屏障功能起主要的调控作用。这些结果为进一步研究脑血管血脑屏障功能的表观遗传调控机制奠定了理论基础。 

　　鉴于脑血管内皮细胞富集蛋白质的水平与其转录本水平显著的非相关性，研究人员随后专注于验证之前未报道过的脑血管内皮细胞富集蛋白质。通过全面的筛选和特异性验证，研究人员找到了有良好表现、高特异性的免疫荧光染色抗体，从而鉴定了8个蛋白（AFAP1L2, CGNL1, EPS8L2, IGF1R, PALMD, PDXK, SORBS2和TPD52)和转录因子LEF1、SOX17和ERG在成年小鼠脑毛细血管内皮细胞中高表达，并证明了它们在正常成年人类脑毛细血管内皮细胞中同样高表达，表明小鼠和人类脑血管内皮细胞血脑屏障的分子特征有很高的相似性。 

　　最后，为了鉴定这些脑血管内皮细胞富集蛋白在神经系统疾病中的潜在作用、进一步表征血脑屏障的疾病相关分子特征，研究人员在AD小鼠模型5xFAD小鼠及其同窝对照小鼠（9月龄，雄性）中检测了上述富集蛋白及转录因子在疾病发生后的变化。研究结果表明，富集蛋白AFAP1L2、EPS8L2、IGF1R以及转录因子LEF1在5xFAD小鼠大脑海马组织脑血管内皮细胞中发生了显著下调，而其他富集蛋白和转录因子在5xFAD小鼠中没有明显变化。 

　　综上，该研究在转录组、蛋白质组及染色质可及性等多个层面构建了成年小鼠脑血管内皮细胞的分子图谱，鉴定了在脑血管内皮细胞中选择性富集的转录本、蛋白质、顺式调控元件和转录因子，验证了小鼠和人类脑血管血脑屏障分子特征的相似性，并揭示了AD条件下血脑屏障新的分子病理表征。该研究为全面理解脑血管血脑屏障功能的分子机理奠定了研究基础，并为进一步的血脑屏障功能研究和疾病干预提供了理论依据和候选靶点。 

　　中国科学院深圳先进技术研究院助理研究员余敏、中山大学中山医学院博士生聂雅阁、中山大学生命科学学院博士生杨嘉文及中国科学院深圳先进技术研究院助理研究员杨时伦为论文的共同第一作者。中国科学院深圳先进技术研究院畅君雷研究员、中山大学生命科学学院徐锦教授、美国斯坦福大学Calvin J. Kuo教授为论文的共同通讯作者。研究还得到了美国斯坦福大学的Howard Y. Chang教授团队和Michael P. Snyder教授团队、郑州大学第一附属医院的郭付有教授及其团队成员宋登攀的重要帮助和指导。本研究获得了国家自然科学基金委、科技部、广东省、深圳市、中科院、香港裘槎基金会以及广东省脑血管病转化医学创新平台等各方的资助。 

　　图1. 小鼠脑血管内皮细胞特异性富集转录本与蛋白质相关性分析

　　图2. 研究的整体实验设计和思路

论文链接

（畅君雷课题组长期聚焦于研究脑血管疾病的发病机制和靶向干预新策略开发，尤其关注血脑屏障功能形成、维持与紊乱的分子调控机制和生理病理作用，旨在为脑血管疾病及相关神经系统疾病的预防和治疗提供新的思路和干预靶点，部分研究成果已经进入临床试验阶段。若有意向开展学术合作或加入本团队共同开展本方向研究，请联系：jl.chang@siat.ac.cn）