微生物基因组中蕴藏着大量尚未被认识和利用的生物合成潜力，犹如生命科学领域有待探索的“暗物质”。这些隐藏在基因组中的生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters，BGCs），可能编码结构新颖、具有潜在药用价值的天然产物。其中，多肽类药物凭借其较高的靶点选择性和丰富的生物活性，已成为现代药物研发的重要方向，在抗感染、代谢性疾病及肿瘤治疗等领域展现出广阔前景。然而，尽管基因组测序技术已能够识别大量潜在的生物合成基因簇，如何将这些遗传信息转化为实际的天然产物，仍然面临巨大挑战。尤其是编码具有丰富结构多样性的非核糖体肽的生物合成基因簇（NRPS基因簇），因其序列庞大、重复区域多，克隆与表达重构过程复杂，难以实现高效、规模化研究。

近日，中国科学院深圳先进技术研究院罗小舟研究员团队依托深圳合成生物研究重大科技基础设施，开发了一套大型基因簇自动化组装与重构平台OSAR（One-Step Assembly and Refactoring）。该平台将计算机辅助设计与自动化实验相结合，无需定制DNA合成，即可通过一次DNA组装同步完成大型基因簇的克隆与表达重构，将传统复杂的人工操作转化为标准化、自动化的工作流程，为挖掘微生物“生命暗物质”提供了新的技术手段。

研究团队利用OSAR平台对34个NRPS基因簇进行了系统验证，成功组装其中31个基因簇（成功率约91%），并从10个基因簇的异源表达体系中检测到29种肽类产物，包括多种此前未报道的天然产物。平台可在约10天内完成基因簇组装与表达菌株构建，展示了合成生物学重大科技基础设施在推动复杂生物学实验自动化、规模化及加速天然产物发现方面的应用潜力。

01 基于PARBiG的基因簇自动化克隆与重构设计

大型BGC的高通量重构面临的主要瓶颈之一，是不同基因簇往往需要分别设计实验方案，难以形成标准化、可程序化的操作流程。为解决这一问题，本研究采用酿酒酵母介导的体内同源重组策略，将 BGC 拆分为多个 DNA 片段，并按照预设顺序组装为表达操纵子。

基于这一策略，原本依赖人工逐一完成的克隆与重构方案设计，可转化为由序列信息驱动的程序化流程，主要包括目标基因扩增引物设计、核糖体结合位点（RBS）配置及同源臂添加。为此，本研究开发了具有网页操作界面的 PARBiG 软件，实现从基因簇序列解析到引物设计及组装验证引物生成的自动化处理。

PARBiG首先分析BGC序列中的重复区域，并根据基因长度及重复序列分布确定DNA片段的划分方案；随后，以Primer3为核心引擎设计扩增引物，并在相应引物末端整合预设 RBS 序列和同源臂，最终生成可直接用于实验的引物序列。此外，软件还能够模拟DNA片段的预期组装过程，并自动设计用于验证片段连接位点的检测引物，为后续的自动化组装与表达重构提供标准化的设计基础。

PARBiG需要四个输入文件：经过注释的BGC序列、目标基因文件、标准化RBS序列库以及用于组装的载体骨架。用户可通过基因列表指定待克隆基因的排列顺序，并标注各基因是否需要添加RBS；RBS库则依据实验测定的表达水平进行排序。软件根据预设的基因排列顺序，自动为上游基因分配表达强度较高的RBS，为下游基因分配表达强度较低的RBS。

在引物设计过程中，PARBiG首先自动提取目标基因序列，并将非ATG起始密码子转换为ATG，以适应后续表达构建的设计需求。随后，软件根据基因长度采用不同的处理策略：对于长度小于10 kb的基因，直接利用Primer3进行引物设计；对于长度超过10 kb的基因，则进一步采用考虑重复序列的分段策略，以提高PCR扩增的可靠性。

软件首先利用BLASTn识别长度超过50bp、序列一致性高于设定阈值的重复区域，默认一致性阈值为75%。在此基础上，非重复区域被划分为固定长度的10 bp单元，而重复区域则作为完整单元保留，避免在重复序列内部进行不必要的切分。随后，软件通过贪心算法，在单个片段长度不超过10 kb的约束下，将这些单元组合为连续的DNA片段，以获得长度分布相对均衡的扩增片段，并据此设计相应引物。

完成初步引物设计后，PARBiG进一步将预设RBS序列和同源臂整合至扩增引物中，生成可直接用于酿酒酵母体内同源重组组装的最终引物。同时，软件在计算机中模拟组装各DNA片段，并针对预期组装产物的连接区域设计特异性验证引物，用于后续构建体的连接位点验证。通过将基因簇序列解析、重复区域识别、DNA片段划分、引物设计、表达调控元件整合和组装产物验证等步骤集成于统一的软件流程，PARBiG将传统人工设计通常需要数小时的工作压缩至每个基因簇数秒内完成。

02 自动化驱动的基因簇表达菌株构建

为配合PARBiG网站完成的计算机辅助设计，并提升OSAR平台在基因簇构建与产物测试阶段的处理能力，研究团队建立了一套全自动化湿实验流程。该系统部署于中国深圳的合成生物学基础设施平台，主要由Tecan Fluent 780自动化液体处理工作站和Spinnaker机器人组成。

其中，液体处理工作站负责高精度液体分配及样品处理，机器人则负责不同实验设备和实验板之间的自动转运。通过两者的协同运行，系统能够以极少的人工干预完成PCR反应体系配置、核酸纯化、DNA浓度均一化、酿酒酵母组装、菌落挑取、质粒回收以及枯草芽孢杆菌转化等关键操作，实现从DNA片段制备到表达菌株构建的流程化衔接。

在具体实施过程中，首先利用PARBiG设计的引物对目标基因簇进行平行PCR扩增，获得所需DNA片段；随后采用磁珠法纯化扩增产物，并对DNA进行标准化处理，再通过酿酒酵母的同源重组完成基因簇组装。组装完成后，利用菌落PCR对候选构建体进行验证，并从酵母中提取组装产物，直接转化至异源表达宿主枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），无需经过中间宿主进行质粒扩增。

这一流程减少了传统多步克隆操作中的人工干预和宿主转换环节，能够在约10天内构建数十个表达菌株。在产物测试阶段，系统进一步整合了QPix 420自动化菌落挑取设备、96孔板并行发酵流程、培养上清液自动提取以及液相色谱–质谱（LC–MS）分析。

03 高通量 NRPS 基因簇克隆与重构

为系统评估OSAR平台对不同规模和结构复杂度的NRPS基因簇的组装与表达能力，研究团队从芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、短芽孢杆菌属（Brevibacillus）、致病杆菌属（Xenorhabdus）和光杆菌属（Photorhabdus）中，选取了34个具有代表性的NRPS基因簇。

这些基因簇长度为7.0–78.3kb，包含1–14个基因。随后，利用PARBiG对所选基因簇进行自动化引物设计。34个基因簇共涉及153个基因，其中41个基因长度超过10kb，按照软件的重复序列识别与片段划分策略进行分段扩增。所有基因簇的启动子和RBS均被替换，另有9个基因簇进行了基因排列重构；同时，对18个基因簇中的30个基因，将非ATG起始密码子转换为ATG，以适应后续异源表达构建的设计要求。

在自动化构建过程中，共开展241次PCR反应，获得204个高质量扩增产物；通过将退火温度调整±2 ℃，进一步成功扩增出31个片段。最终，34个目标基因簇中有31个成功获得所需基因片段，并且这31个基因簇均在酿酒酵母中实现了重构。

基于连接位点特异性菌落PCR检测，各基因簇获得正确组装克隆的比例为10%–100%。成功组装的基因簇不仅包括由多达11个片段组成、长度超过60kb的复杂基因簇，也包括重复序列含量极高的基因簇。例如，NRPS25和NRPS28的重复序列含量分别达到93.89%和88.04%，仍然实现了成功组装，体现了OSAR在处理大型、高重复性和结构复杂的BGC方面的能力。随后，所有重构成功的酵母质粒均被转化至枯草芽孢杆菌MG27-comKS表达宿主中，用于异源表达。

通过对表达菌株粗提物进行液相色谱–质谱（LC–MS）及串联质谱（MS/MS）分析，研究共从10个基因簇中检测到29种肽类产物，其质荷比（m/z）范围为331.2–1259.7。根据基因簇注释、质荷比信息和串联质谱分析结果，这些产物被进一步分类：其中14种肽类产物（3、8–11、18–26）的肽链长度或环大小与已知肽类化合物存在差异；5种（1、2、4、6、27）属于已知化合物的变体；6种（5、12–15、28）对应已知天然产物。另有4种产物（7、16、17、29）的质荷比与已报道化合物不同，但其完整结构组成仍有待进一步解析。

在与天然产生菌的比较中，OSAR平台展现出激活隐性生物合成途径及改变产物表达谱的能力：NRPS3、NRPS11、NRPS21和NRPS30的相关产物在天然菌株中未被检测到；NRPS14、NRPS15和NRPS33在异源宿主中的产物水平更高；NRPS16和NRPS34则产生了与天然菌株相同种类的肽类产物，但各变体的相对比例发生了变化。这些结果表明，OSAR能够揭示天然菌株中未检出或低水平积累的代谢产物，并呈现不同于天然宿主的产物谱。

研究进一步选取NRPS11、NRPS15和NRPS30三个基因簇，对其产物进行分离纯化、结构解析及生物合成途径探究。NRPS11产生了脂肪酸连接的八肽lateropeptin，其结构提示生物合成过程中可能存在模块跳跃。NRPS15产生了四种此前未报道的脂肽sporolipins，揭示了因其他优势表达的NRPS途径竞争而被掩盖的产物发现问题。NRPS30则产生了多种结构不同的脂肽mycosins，其中部分短肽经实验证实与第三个模块后的提前释放有关，另一种产物则可能涉及模块跳跃。这些研究揭示了NRPS生物合成过程中非经典的产物形成方式，也表明仅依赖生物信息学预测难以准确推断最终产物。

总体而言，OSAR将计算机辅助设计、自动化基因簇组装与异源表达相结合，不仅提高了大型、复杂NRPS基因簇的构建效率，还为激活隐性生物合成途径、发现被优势代谢产物掩盖的化合物，以及探索模块跳跃和提前释放等非经典合成机制提供了系统化的实验平台。

04 总结与展望

展望未来，OSAR工作流程有望进一步拓展至聚酮合酶及 NRPS–PKS杂合系统等其他类型的生物合成基因簇，并通过模块化载体设计适配不同的微生物表达宿主。在此基础上，将自动化通路设计与实验验证相结合，逐步建立设计、构建、测试与学习相衔接的迭代优化流程，有望持续改进生物合成通路的设计与表达。进一步结合调控元件的系统优化与机器学习辅助设计，可望提高异源表达的效率与可预测性，拓展工程化微生物宿主可利用的生物合成通路范围。

作者与资助

中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所助理研究员黎志波为该论文第一作者，深圳先进院合成生物学研究所罗小舟研究员和加州伯克利大学Jay D. Keasling院士和暨南大学高昊教授为共同通讯作者。本研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、深圳市医学研究专项基金、广东省基础与应用基础研究基金、深圳市科技计划以及SIAT杰出青年学者的支持。

图1. OSAR平台总览

图2. PARBiG工作流程

图3. 利用OSAR平台高通量表达NRPS基因簇